REVISION (BIOLOGIA) Acta Cient��fica Venezolana, 51: 197���206, 2000 UNA DECADA DE APLICACION DEL METODO RAPD: ALCANCES Y LIMITES EN EL ESTUDIO DE RELACIONES GENETICAS EN PLANTAS Nereida Xena de Enrech Laboratorio de Biosistem��tica y Citogen��tica Vegetal, Instituto de Biolog��a Experimental, Facultad de Ciencias, U.C.V. Aptado. 47114, Caracas, Venezuela, 1041A nxena@reacciun.ve fenrech@club-internet.fr Recibido: 27/07/00 Revisado: 08/08/00 Aceptado: 17/10/00 RESUMEN: El m��todo RAPD fue propuesto hace una d��cada como una alternativa al estudio de las relaciones gen��ticas entre organis- mos, generando patrones de bandas polim��rficas, producidas por iniciadores de secuencias arbitrarias a trav��s de la t��cnica de la PCR. Al trabajar con DNA total se origina una gran cantidad de informaci��n sobre los genomas analizados en una forma r��pida y poco costosa. Esta informaci��n puede utilizarse en m��ltiples formas en la gen��tica vegetal, entre ellas, detecci��n de h��bridos, cuantificaci��n de la diver- sidad gen��tica intra e interespec��fica, establecimiento de identidades gen��ticas, an��lisis de variaci��n somaclonal, y en combinaci��n con otros m��todos la elaboraci��n de mapas gen��ticos. Sin embargo, para su correcta aplicaci��n deben tomarse diferentes precauciones, como el control estricto de las condiciones de trabajo y se recomienda (dada la naturaleza an��nima de las bandas y la dificultad de establecer homolog��as) circunscribir su utilizaci��n a nivel espec��fico o infraespec��fico y al momento de establecer comparaciones, utilizar ��nicamente c��lculos de distancia gen��tica en los cuales no intervengan an��lisis parsimoniosos. Palabras clave: RAPD, marcadores moleculares, relaciones gen��ticas. A DECADE OF THE RAPD METHOD: POSSIBILITIES AND LIMITATIONS FOR PLANT GENETIC RELATIONSHIP STUDIES. ABSTRACT: The RAPD method appeared a decade ago as an alternative in genetic relationship studies. The technique generates poly- morphic band patterns, produced by PCR using arbitrary DNA sequence primers. If total DNA is used, RAPD yields abundant information about the analyzed genome in a rapid and inexpensive way. This information may be used in various types of plant genetic studies, such as hybrid detection, intra and interespecific genetic variation, genetic identity establishment, somaclonal variation analysis and, when com- bined with other methods, it helps in the elaboration of genetic maps. However, there are some requisites for its correct application. A strict control of working conditions is demanded. Furthermore, due to the anonymous character of polymorphic bands and the difficulties for establishing homologies, it is also recommended to confine RAPD uses to the specific or infra specific levels. Comparisons based on genetic distance calculations are accepted provided they do not require parsimony analysis methods. Key words: RAPD, molecular markers, genetic relationships. INTRODUCCION En 1990 fue presentado independientemente por dos equipos de investigadores, un m��todo que propone la uti- lizaci��n de iniciadores (���primers") arbitrarios para obtener marcadores moleculares en cualquier tipo de genoma apli- cando la t��cnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction). Tanto J. Welsh y M. McClelland7 , como J.G.K. Williams y col.7 convinieron que los dos trabajos deben ser con- siderados como publicados simult��neamente y deben ser citados conjuntamente. Welsh y McClelland7 denominaron el m��todo ���arbitra- rily primed PCR��� (AP-PCR) y se��alan que, en principio, puede ser aplicado para detectar polimorfismos (expresa- dos como bandas separadas por electroforesis) en una amplia variedad de organismos usando diferentes inicia- dores de secuencias arbitrarias. Por lo tanto el m��todo no requiere de un conocimiento previo de la biolog��a mo- lecular de los organismos que van a ser investigados. Los iniciadores preferiblemente deben pertenecer a grupos es- t��ndar para facilitar la comparaci��n de resultados entre la- boratorios, y proponen la utilizaci��n, en principio, de ini- ciadores ya conocidos utilizados para otros prop��sitos y que tengan alrededor de 20 pares de bases. Los auto- res alertan sobre la importancia de verificar la posibilidad de reproducir las bandas marcadoras resultantes y predi- cen que la aplicaci��n de este nuevo m��todo ser�� ��til en programas reproductivos, mapas gen��ticos, gen��tica de poblaciones y epidemiolog��a. Williams y col.7 denominan el m��todo que describen como ���Random Amplified Polymorphic DNA��� (RAPD) y a los polimorfismos que se producen proponen llamarlos ���marcadores RAPD". Lo destacan como un proceso sim- ple basado en la amplificaci��n de DNA gen��mico con ini- ciadores (uno por reacci��n PCR) de secuencia de nucle��- tidos arbitraria, que detecta polimorfismos que funcionan como marcadores gen��ticos. A diferencia de Welsh y Mc- Clelland, los iniciadores propuestos por Williams y col. tie- nen s��lo 9 �� 10 nucle��tidos de longitud y una composici��n en G+C entre 50% y 80%. Cada iniciador amplifica por PCR varios segmentos de DNA (detectados por electro- foresis en gel de agarosa te��ido con bromuro de etidio) y en muchos de ellos aparecen polimorfismos entre las es- pecies analizadas (tanto de organismos procariotas como de eucariotas). Otra importante particularidad que se��a- lan estos autores respecto a la mayor��a de los marcado-

198 Xena de Enrech res RAPD es su car��cter dominante: no es posible dis- tinguir cuando un segmento de DNA ha sido amplificado a partir de un locus heterocigoto (1 copia) u homocigoto (2 copias)6 . En los raros casos en que los marcadores RAPD son codominantes se observan como segmentos de diferentes tallas amplificados a partir de un mismo lo- cus. Por esta raz��n, para utilizar los marcadores RAPD para elaborar mapas gen��ticos deben usarse l��neas puras homocig��ticas como parentales. Como aplicaciones del m��todo RAPD, Williams y col. proponen la elaboraci��n de mapas gen��ticos, aplicaciones reproductivas en plantas y animales y como productor de marcadores moleculares en estudios de gen��tica de poblaciones. El m��todo RAPD (de los dos nombres este fue el que se impuso) fue adoptado de inmediato por su simplicidad y bajo costo, no requerir de marcadores radioactivos y utilizar cantidades m��nimas de DNA. El polimorfismo de- tectado puede deberse a un simple cambio de un par de bases, inserciones o deleciones (indels), que modifican o eliminan el sitio de inserci��n del iniciador o tambi��n inser- ciones en la secuencia gen��mica que separan los sitios de inserci��n del iniciador a una distancia que no permite la amplificaci��n (la distancia m��xima de inserci��n de las dos copias del iniciador no deben exceder 2500 pb para lograr la amplificaci��n del segmento). Las bandas gene- radas se pueden clasificar de acuerdo a su intensidad de tinci��n (fuerte, mediana, d��bil) frente al bromuro de eti- dio, lo cual puede ser un reflejo de la especificidad de la amplificaci��n. Debido a su ���herencia dominante", los marcadores RAPD se expresan como presencia o ausencia de un pro- ducto amplificado, lo cual se traduce en una p��rdida de informaci��n si se les compara con marcadores heredados como ���codominantes", como es el caso de las isoenzimas. Sin embargo, los RAPDs proveen una enorme fuente de datos y por lo tanto pueden ser m��s informativos acerca de la estructura de las poblaciones y su diversidad gen��ti- ca que las isoenzimas9 . REPRODUCCION DE LOS RESULTADOS, ESTANDARI- ZACION DEL METODO Una de las preocupaciones que desde su aparici��n sus- cit�� el m��todo RAPD fue la posibilidad de reproducir los resultados obtenidos. Para poder garantizar la reproduc- ci��n de los resultados, al iniciarse un estudio con aplica- ci��n de este m��todo, deben establecerse las condiciones ��ptimas en los dos pasos fundamentales del proceso: ex- tracci��n y amplificaci��n del DNA. Respecto a la extracci��n del DNA de tejidos vegetales, para la cual existen protoco- los bien establecidos 66 , en el caso de la aplicaci��n del m��todo RAPD se ha sugerido que las sustancias con- taminantes que precipitan junto al DNA en el etanol son una de las primeras causas de la falta de reproductibili- dad en los resultados, debido a que estos contaminantes pueden afectar la inserci��n efectiva del iniciador 5 . Pa- ra evitar este inconveniente, se sugiere recuperar el DNA precipitado en etanol utilizando una varilla de vidrio y no por centrifugaci��n5 . En cuanto a la estandarizaci��n del protocolo de ampli- ficaci��n deben establecerse las concentraciones ��ptimas, de acuerdo al material a utilizarse, de Mg , de la enzima Taq DNA Polimerasa, del iniciador y del DNA. Una vez es- tandarizadas las condiciones, ��stas deben mantenerse in- variables durante todas las reacciones PCR en las cuales se utilice el material biol��gico para el cual fueron estable- cidas. Todas estas precauciones no parecen garantizar, en ciertos casos, un 100% de reproducci��n de los resultados. Skroch y Nienhuis 6 evaluaron - utilizando las distancias gen��ticas estimadas, calculadas a partir de diferentes pa- trones de bandas RAPD obtenidos con 50 iniciadores en 10 genotipos de Phaseolus vulgarisL. (frijol, caraota) - el error en la obtenci��n de los datos (visualizaci��n y anota- ci��n de las bandas) y la amplitud de la reproductibilidad de los resultados. La medida del error en la obtenci��n de los datos fue del 2% y la posibilidad de reproducirlos, expre- sada como el porcentaje de bandas RAPD visualizadas y anotadas que tambi��n lo fueron en los datos replicados, fue del 76%. Estos autores coinciden en que la reproduc- ci��n de los resultados depende estrechamente de la uni- formidad de las condiciones de amplificaci��n entre los ex- perimentos. Tambi��n puede incrementarse seleccionando los iniciadores que producen resultados con un grado ma- yor de reproducci��n del patr��n de bandas que generan. Tambi��n se ha sugerido que el patr��n resultante de una reacci��n RAPD est�� en parte determinado por la compe- tencia que se establece entre los sitios del genoma donde puede anclar un determinado iniciador 7 . Halld��n y col. utilizaron un doble haploide de l��neas puras de Brassica napus para probar la habilidad de los marcadores RAPDs de funcionar como verdaderos marcadores dominantes: prepararon un h��brido artificial en el cual un parental per- tenec��a a una l��nea pura donde estaba presente una de- terminada banda y el otro, a una l��nea pura donde dicha banda estaba ausente en estos casos se espera (como en la herencia mendeliana) en el heterocigoto, la presen- cia absoluta de la banda. Sin embargo, de 613 heteroci- gotos analizados la aparici��n de la banda fall�� en 84 ca- sos (14%). Los autores interpretan estos resultados como errores debidos a la competencia en la amplificaci��n de to- dos los fragmentos RAPD capaces de producirse en una reacci��n. Heun y Helentjaris6 tambi��n abordaron el problema de constatar la forma en que se heredan los fragmentos RAPD. Utilizaron 5 genotipos diferentes de ma��z y dise��a- ron cruces para obtener diferentes tipos de combinaciones h��bridas F . Clasificaron el polimorfismo obtenido en ���no ambiguo��� o dial��lico (presencia o ausencia de bandas) y polimorfismo ���cuantitativo��� (variaci��n de intensidad de tin- ci��n en los respectivos productos de los parentales). En promedio obtuvieron 6,7 fragmentos por iniciador de los cuales s��lo el 20,7 % fueron no polim��rficos. En su es- tudio los RAPD se reflejaron como marcadores gen��ticos eficientes, no observando nunca un fragmento en F que