乙酰辅酶A羧化酶的分离和纯化

Abstract

自2,4-D(氯化苯氧乙酸类除草剂)于1946年在农业中得到广泛使用以来,化学除草剂工业已有了60多年的发展历史。化学除草剂的使用为农业的现代化提供了很好的保障和支持。随着各门学科的不断发展,药物发现和药物设计也迈入了一个新的里程,以生物体的蛋白酶为作用靶标的除草剂在这一时期也有了很大的发展,相继开发出了一系列的高效抑制剂,如乙酰辅酶A羧化酶抑制剂等。 乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Coenzyme A Carboxylase,Accase),属于biotin-dependent酶家族,它在生物体中的重要功能在于它能催化羧基转移,为脂肪酸的合成提供底物-丙二酸单酰CoA。在脂肪酸合成途径中,Accase催化的反应不仅是第一步也是关键的反应步骤,同时也是限速步骤,因此Accase被认为是一个新型高效的除草剂作用靶标。虽然对Accase抑制剂的研究已有近30年的历史,并以CHDs(环已烯二酮类化合物)和AOPPs(芳氧基苯氧基丙酸脂类化合物)除草剂为代表,但由于其毒性强、使用剂量大、杂草抗药性等缺陷限制了其在农业上得到进一步的应用。因此如何优化现有的抑制剂结构和开发基于Accase活性的新型农药品种对农业的发展具有重要意义。 本论文根据优化现有抑制剂结构和开发新型农药的实际需要,从生物体中提取具有生物活性的蛋白酶,并建立其抑制剂先导化合物的筛选方法。论文工作主要包括两个方面的内容:(1)Accase的分离与纯化;(2)Accase的活性、比活力和米氏常数K_m的测定。 (1)Accase酶的分离和纯化 以玉米白化苗为原料,经过研磨、匀浆,缓冲液溶解、30～50%硫酸铵盐析沉淀得到粗蛋白酶。粗蛋白酶再经过Sephacry S-300凝胶过滤柱层析、Blue SepharoseCL-6B染料亲和柱层析获得纯度较高的Accase酶。 (2)Accase酶的活性、比活力和米氏常数K_m的测定 以ATP为反应底物,采用Mono Q阴离子交换柱层析检测分析底物的水解产物,跟踪检测Accase提取纯化过程中各步骤获得的Accase的活性和比活力,测定出其最大比活力可达到1.09μmol·mg~(-1)·min~(-1),测定了Accase对底物ATP的米氏常数K_m为37.05μmol·L~(-1)。