Standardization of a nested RT-PCR technique for alphavirus detection

Abstract

El género Alphavirus está constituido por virus de ARN de los cuales, varias especies son causantes de enfermedades humanas y animales como los virus chikungunya, Mayaro y los virus de encefalitis equinas, por lo que son considerados un problema de salud pública a nivel regional. En Paraguay han sido reportadas infecciones humanas por chikungunya pero son necesarios más estudios para ampliar conocimientos sobre circulación y ecoepidemiología de los alfavirus. La transcripción reversa de ARN seguida de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) anidada es de gran utilidad como herramienta diagnóstica y en la vigilancia epidemiológica. El objetivo de este estudio fue definir las condiciones óptimas de reacción y determinar el límite de detección para una RT-PCR anidada para la detección genérica de alfavirus. El límite de detección obtenido, de 0,47 UFP/mL, indica una alta sensibilidad, pudiéndose aplicar la técnica a muestras humanas y animales de suero, líquido cefalorraquídeo, órganos y a pooles de mosquitos. Este trabajo servirá de base a otros estudios de detección e identificación de especies de alfavirus circulantes en nuestro país, lo que contribuiría a fortalecer su vigilancia y prevención. Palabras clave: Alphavirus, RT-PCR anidada, estandarización. A B S T R A C T The genus Alphavirus consists of RNA viruses of which several species are responsible for human and animal diseases, such as chikungunya, Mayaro and equine encephalitis viruses, and are therefore considered a regional public health problem. In Paraguay, human infections have been reported by chikungunya, but more studies are needed to increase knowledge on the circulation and ecoepidemiology of alphaviruses. Reverse RNA transcription followed by a nested polymerase chain reaction (RT-PCR) is very useful as a diagnostic tool and in epidemiological surveillance. The objective of this study was to define optimal reaction conditions and to determine the limit of detection for a nested RT-PCR for generic alphavirus detection. The detection limit obtained, of 0,47 PFU/mL, indicate high sensitivity, and the possibility of applying the technique to human and animals samples of serum, cerebrospinal fluid, organs and mosquito pools. This work will serve as a basis for other studies of detection and identification of alphavirus species circulating in our country, which would help strengthen the surveillance and prevention.