Estandarización de la técnica de PCR-RFLP de la región ITS1, para la caracterización molecular de Leishmania (L) infantum, en muestras caninas

Abstract

Estandarización de la técnica de PCR-RFLP de la región ITS1, para la caracterización molecular de Leishmania (L.) infantum, en muestras caninas Cómo referenciar este artículo/ How to reference this article: Céspedes Chaves E, Portillo N, Thomaz-Soccol V, Gonçalves AL, González Brítez N. Estandarización de la técnica de PCR-RFLP de la región ITS1, para la caracterización molecular de Leishmania (L.) infantum, en muestras caninas. La leishmaniasis es una enfermedad producida por protozoarios parásitos del género Leishmania. Estos parásitos infectan a hospedadores mamíferos, entre los cuales los perros han sido implicados como reservorios del parásito. Este trabajo planteó estandarizar la técnica de la PCR-RFLP luego de la amplificación de la región ITS1 de Leishmania spp, como herramienta útil para la detección y caracterización molecular. Se utilizaron promastigotes de cultivo y muestras de biopsias procedentes de perros con leishmaniasis visceral previamente diagnosticados en el Centro Antirrábico Nacional. La región ITS1 del ADN genómico nuclear de Leishmania spp. fue amplificada utilizando los cebadores LITSR y L5,8S. La técnica ITS1 PCR-RFLP aplicada, permitió la detección de Leishmania (Leishmania) infantum en 10/10 aislados de parásitos mantenidos en medio NNN, en 10/18 muestras de bazo y 10/18 muestras de ganglio linfático poplíteo. Las condiciones óptimas de reacción fueron 0,2 mM de dNTPs, 0,1 pmol de cada cebador y 1U de Taq polimerasa. La sensibilidad de la PCR fue de 3 ng/µL de ADN en aislados de cultivo NNN y 60 ng/µL de ADN en muestras de biopsias, mientras que la especificidad fue de 100% para la detección de Leishmania sp. La enzima de restricción Hae III, determinó fragmentos de 184, 72 y 55 pb., que resultaron específicos para la especie Leishmania (L.) infantum. El marcador utilizado resultó confiable para la detección y caracterización de Leishmania sp. en perros procedentes de zonas endémicas, lo cual podría ser útil para verificar las especies de parásitos circulantes entre los perros. Palabras claves: Leishmania infantum, perros, ITS-1 (Espaciador transcripto interno 1). Standardization of PCR-RFLP technique of the ITS-1 region for Leishmania (L.) infantum molecular characterization in canine samples A B S T R A C T Leishmaniasis is a disease caused by protozoan parasites of the genus Leishmania. These parasites infect to mammalian hosts, including canines that have been implicated as reservoirs of the parasite. The aim of this research was to standardize the technique of PCR-RFLP after amplification of the ITS1 region of Leishmania (Leishmania) infantum, as a useful tool for detection and molecular characterization. Promastigotes from culture and biopsies from dogs with visceral Leishmaniasis previously diagnosed by the Centro Antirrábico Nacional. The ITS1 region of the genomic DNA of Leishmania sp. was amplified using LITSR and L5,8S primers. The technique ITS1 PCR-RFLP applied, allowed the detection of