Determinación de fenilalanina y galactosa total a partir de una muestra de sangre seca en papel de filtro: aplicación al tamizaje neonatal

Abstract

Los programas de tamizaje neonatal para alteraciones metabólicas deben incluir como mínimo la detección de fenilcetonuria e hipotiroidismo congénito. En este estudio evaluamos un método que cuantifica el valor de galactosa total (Gal) y fenilalanina (Phe) a partir de un disco de sangre seca en papel de filtro, eluido con agua destilada, previa desproteinización con metanol-acetona; posteriormente, se transfirieron 10 uL del eluido a una placa ultramicroELISA y se le añadió la mezcla de reactivos para determinar Phe; al remanente se le añadieron los reactivos para cuantificar Gal. El método fue lineal en un rango de concentración de 0-50 mg/dL para Phe y 0-60 mg/dl para Gal; el límite de detección para Phe/Gal fue de 0,14/0,9 mg/dl; se evaluaron tres muestras con niveles bajo, medio y elevado de Phe/Gal y se obtuvo una imprecisión intraensayo de 6,8 ± 1,7/7,8 ± 2% y una imprecisión interensayo de 5,4 ± 0,7/7,5 ± 1,8%, respectivamente. La recuperación analítica fue de 100,2% ± 1,9% para Gal y 100,3% ± 1,7% para Phe. No se evidenciaron interferencias con los antibióticos evaluados. Se realizó un estudio con 1.000 muestras de neonatos entre las que se encontraron cuatro muestras con concentraciones de Phe y dos con concentraciones de Gal por encima de los niveles de corte para estos analitos. Se obtuvo una excelente correlación lineal entre los dos métodos con que fueron evaluadas de forma comparativa las muestras (UMTEST PKU e ICN GAL-M W EA). Este método permite incorporar una enfermedad metabólica de baja incidencia (galactosemia 1:30.000), en un programa de tamizaje masivo para la detección de fenilcetonuria, lo que justificaría el costo del tamizaje neonatal. Palabras clave: galactosemia, fenilcetonuria, tamizaje neonatal. Phenylalanine and total galactose measurement from dried blood spotted on filter paper application to newborn screening Neonatal screening programs for metabolic disorders are recommended especially for phenylketonuria and congenital hypothyroidism. The present study was designed to adapt, develop and evaluate a SUMA method for total galactose (Gal) and phenilalanine (Phe) measurement on filter paper blood specimens. A single 5 mm disk with blood was deproteinized with methanol-acetone and eluted with distilled water. Ten µl of the extract was transferred to one well of a ultramicroELISA plate, and the reaction solution was added to determine Phe level. The remaining extract was used for the GAL determinations. The method showed good linearity in a 0-50 mg/dl concentration range for Phe and 0-60 mg/dl for Gal. The detection limit was 0.14 mg/dl for Phe and 0.9 mg/dl for Gal. Reproducibility was assessed with filter paper blood specimens containing Gal and Phe at low, middle and high levels. Intraassay coefficients of variation were 10%, 7.5%, 6.22%, and 8.5%, 7%, 5%, respectively, whereas interassay coefficients of variation were 9.54%, 6%, 7% and 6%, 4.6%, 5,6%, respectively. In 1,000 samples from newborns, four samples of Phe and two samples of Gal showed a concentration below the treshold set for each assay. This method provides a rapid means to survey for a low incidence disease (i.e., galactosaemia: incidence, 1/30,000), in existing phenylketonuria analysis programs, where an incidence of 1/ 10,000), easily justifies the cost of mass screening.