Artificial Protein Synthesizing System Using Extended Genetic Code

Abstract

ノ酸の部位特異的導入法が開発されたことで，天然の 20 種類以外にもさまざまな非天然アミノ酸をタンパ ク質に導入することが可能になった 1), 2) ．すなわち， 終止コドンの 1 つアンバーコドン UAG に相補的なア ンチコドンをもち非天然アミノ酸を結合させた tRNA を合成しておき，望みの導入部位のコドンを UAG に 置換した遺伝子とともに無細胞翻訳系に加えること で，UAG を非天然アミノ酸に翻訳させることが可能 になった．しかし，UAG は本来は終止コドンである ために，終結因子が認識してタンパク質合成を停止さ せてしまう．そのために，非天然アミノ酸の導入効率 はあまり高くなかった．また，遺伝暗号表には終止コ ドンが 3 つしかないために，そのうちの 1 つを本来の 終止コドンとして使うとして，最大でも 2 種類の非天 然アミノ酸しか導入することはできない．実際には UAG 以外の終止コドンでは終結因子の活性が勝るた めに，実質的には 1 種類の非天然アミノ酸のみが導入 可能であった． 一方，筆者らは終止コドンを流用するのではなく， 通常は 3 塩基であるコドンを 4 塩基に拡張することで， 新たに非天然アミノ酸を割り当てる手法の開発を行 なってきた 3)-5) ．これにより非天然アミノ酸の効率的 導入および多重導入が達成され，さまざまな応用も可 能になってきている．本稿ではこの 4 塩基コドン法の 原理について解説するとともに，その応用例について 紹介したい． 24 コドンによるアミノの Fig. 1 には 4 塩基コドン法の原理を，CGGG を例と して示している．まず，遺伝子上で非天然アミノ酸に 置換したい部位のコドンを 4 塩基コドン CGGG に置 換しておく．また，この 4 塩基に相補的な配列 CCCG をアンチコドンにもつ tRNA を合成しておき，化学的 アミノアシル化法を用いて非天然アミノ酸を結合させ る．これらを無細胞翻訳系へ添加すると，4 塩基コド ンに置換した部分が 4 塩基アンチコドンをもつ tRNA に読み取られ，非天然アミノ酸へ翻訳される．一方， それ以外の部分は通常通り 3 塩基ずつ天然のアミノ酸 へ翻訳されるため，得られるタンパク質には 4 塩基コ ドンで指定した部位のみに非天然アミノ酸が導入され ることになる．ただし，4 塩基コドンの最初の 3 塩基 CGG が天然のアミノアシル tRNA によって翻訳され ることも起きうるが，その場合は読み枠が 1 塩基分ず れて，やがて下流に現れる終止コドンによってタンパ ク質合成は終了してしまう．そのため，非天然アミノ 酸が導入された場合のみ，完全長タンパク質が得られ ることになる．この際，C 末端に精製用の His-tag な どを付加しておくことにより，非天然アミノ酸が導入 された完全長タンパク質のみを容易に単離することが