Genetic transformation of Eucalyptus camaldulensis by agrobalistic method

Abstract

Eucalyptus stands in the setting of worldwide forestry due to its adaptability, rapid growth, production of high-quality and low cost of wood pulp fibers. The eucalyptus convetional breeding is impaired mainlly by the long life cycle making the genetic transformation systems an important tool for this purpose. However, this system requires in vitro eficient protocols for plant induction, regeneration and seletion, that allow to obtain transgenic plants from the transformed cell groups. The aim of this work was to evaluate the callus formation and to optimize the leaves and callus genetic transformation protocol by using the Agrobacterium tumefaciens system. Concerning callus formation, two different culture media were evaluated: MS medium supplemented with auxin, cytokinin (M1) and the MS medium with reduced nitrogen concentration and supplemented with auxin, cytokinin coconut water (M2). To establish the leave genetic transformation, those were exposed to agrobiolistics technique (gene gun), to tissue injury, and A. tumesfasciens EHA 105 contening the vetor pCambia 3301 (35S::GUS::NOS), for gene transference and to establish the callus transformation thoses were exposed only to A. tumefasciens. For both experiments, the influence of different infection periods was evaluated. The M2 medium provided the best values for callus sizea and fresh and dry weight. The leaves genetic transformation using the agrobiolistics technique was effective, the gus gene transient expression could be observed. No significant differences were obtained in the infection periods (4, 6 and 8 minutes). The callus genetic transformation with A. tumefaciens also promotend the gus gene transient expression on the callus co-cultiveted for 15 e 30 minutes. The transformed callus was transfered to a regeneration and selection medium and transformed plants were obtained.O Eucalyptus destaca-se no cenário silvicultural mundial devido à sua adaptabilidade, crescimento rápido e produção de fibra de baixo custo e com alta qualidade. O melhoramento convencional do gênero é dificultado, principlamente, pelo seu longo ciclo de vida, tornando a transformação genética importante ferramenta para esse propósito. Esse processo requer o desenvolvimento de protocolo eficiente de progagação in vitro para indução, regeneração e seleção que permita a obtenção de plantas transgênicas a partir de grupos de células transformadas. Os objetivos deste trabalho foram avalair a formação de calos e otimizar o protocolo de transformação genética de folhas e calos através da infecção por A. tumefaciens. Para a formação de calos foram avaliados dois meios de cultura: meio de cultura MS supplementado com auxina e citocinina (M1) e meio de cultura MS com concentração de nitrogênio reduzida e suplementado com auxinas, citocininas e água de coco (M2). Para estabelecer o protocolo de transformação genética de E. camaldulensis, as folhas foram expostas à técnica de agrobiobalística, utilizando-se o bombardeador com micropartículas para realizar ferimentos nos tecidos; e A. tumefasciens EHA 105 contendo o vetor pCambia 3301 (35S::GUS::NOS) para a transferência do gene, enquanto para a transformação genética dos calos estes foram somente infectados com A. tumefasciens. Em ambos os experimentos foi avaliada a influência de diferentes períodos de infecção. O meio de cultura M2 promoveu os melhores valores de volume, massa seca e massa fresca. A transformação genética de folhas através da técnica de agrobiobalística foi efetiva, sendo possível observar a expressão transiente do gene gus, mas não houve diferenças significativas entre os períodos de infecção (4, 6 e 8 min). Os calos infectados por 15 e 30 min com A. tumefasciens também apresentaram expressão transiente do gene gus quando foram tranferidos para meio de cultura de regeneração e seleção e apresentaram formação de brotos.