AFLP markers differentiate isolates of Colletotrichum gossypii from C. gossypii var. cephalosporioides

Abstract

Fungal diseases in cotton (Gossypium hirsutum), such as anthracnose caused by Colletotrichum gossypii and ramulose caused by C. gossypii var. cephalosporioides, are responsible for large yield losses. These pathogens are seed borne and morphologically similar although they induce different symptoms, which can lead to misdiagnosis using the blotter testing method. The present study was carried out to assess the viability of using Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) markers to differentiate these pathogens. Five isolates, for each pathogen, were classified according to pathogenicity on cotton plants, and mycelial growth morphology. Conidial suspensions were sprayed on 30-day-old cotton plants and the symptoms assessed ten and 40 days after inoculation. For growth morphology 200 cottonseeds were inoculated with seven-day-old pure cultures, and the mycelial traits observed under a stereoscopic microscope seven days after inoculation. The DNA for AFLP analysis was obtained from seven-day-old fungal mycelia grown in liquid medium, using the Dneasy Qiagen protocol. Using the AFLP technique 318 polymorphic bands were selected to estimate similarities using Dice's Coefficient. The results clearly distinguished between ramulose and anthracnose isolates, which agreed with morphological and pathogenicity testing.Doenças fúngicas em algodoeiro (Gossypium hirsutum), tais como antracnose causada por Colletotrichum gossypii e ramulose causada por C. gossypii var. cephalosporioides, levam a grandes perdas em produtividade. Estes microrganismos são patógenos veiculados por sementes e morfologicamente similares apesar deles induzirem sintomas diferentes, que podem levar a um erro no diagnóstico usando o teste de sanidade com sementes em rolo de papel. O presente estudo foi realizado para acessar a viabilidade do uso de marcadores Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) para diferenciar estes patógenos. Cinco isolados, para cada patógeno, foram classificados de acordo com a patogenicidade e morfologia de crescimento micelial. As suspensões de conídios foram pulverizadas em plantas de algodoeiro com 30 dias e os sintomas avaliados aos dez e 40 dias após a inoculação. Para a morfologia de crescimento micelial, 200 sementes foram inoculadas com culturas puras com sete dias, e as características miceliais observadas sob microscópio esterioscópico sete dias após a inoculação. O DNA para a análise de AFLP foi obtido de micélio fúngico com sete dias, crescido em meio líquido, usando o protocolo Dneasy Qiagen. A técnica AFLP produziu 318 bandas polimórficas que foram selecionadas para calcular as similaridades usando o Coeficiente de Dice. Os resultados claramente distinguiram os isolados causadores de ramulose dos de antracnose, os quais concordam, com dados morfológicos e de patogenicidade.