Sensibilidade dos microssatélites para determinar a pureza varietal em sementes de milho

Abstract

Em um sistema de produção de sementes, o limite de contaminação varietal em lotes de linhagens de milho é zero, de modo que a presença de apenas uma semente de genótipo estranho acarreta a reprovação do lote. Várias técnicas vêm sendo estudadas para determinar a pureza varietal, incluindo marcadores moleculares baseados em polimorfismo de DNA. Nessa pesquisa foi avaliada a sensibilidade da técnica de microssatélites para detectar a presença de sementes de outros genótipos em lotes de linhagens de milho. Utilizaram-se quatro linhagens (L1, L2, L3 e L4), onde as sementes da L2 eram contaminantes da L1 e, as da L4, contaminantes da L3. Para simulação de diferentes níveis de contaminação, 0, 1, 2, 5 e 10 sementes do genótipo estranho foram misturadas a "bulks" de 100 sementes da linhagem comercial. Em seguida, efetuou-se a extração de DNA das amostras de sementes das quatro amostras preparadas. Por outro lado, para simular níveis inferiores de contaminação, foram misturados DNA do genótipo contaminante em níveis de 0,01; 0,013; 0,02; 0,04; 0,1; 0,2; 1; 2; 5; 10 e 100%. A amplificação dos microssatélites foi realizada utilizando o iniciador BNLG125 para a L1+L2 e o BNLG240 para L3+L4. Observou-se que os marcadores microssatélites foram eficientes para determinar a pureza varietal de lotes de sementes de linhagens de milho, utilizados neste estudo, com sensibilidade para detecção de concentrações de DNA iguais ou superiores a 0,01%, apresentando nitidez e repetibilidade, especialmente com a utilização de gel de poliacrilamida. Ao mesmo tempo, a presença de DNA estranho nas amostras constituídas por "bulks" foi detectada eficientemente por essa técnica, indicando a possibilidade de sua utilização em testes de rotina para avaliar a presença de outras cultivares, em lotes de sementes de milho.Genotype contamination in seed production of maize inbred seed lots is not tolerated, i.e. the presence of only one seed from another genotype in a lot is sufficient to discard this lot. Many procedures have been studied to detect genotype purity in different crops, including molecular markers based on DNA polymorphism. This research aimed to evaluate the sensitivity of the microsatellite technique to detect the contaminating seeds in maize inbred lines. Four inbred lines (L1, L2, L3 and L4) were used. Samples of 100 seeds each of L1 were prepared considering L2 as a contaminant while seeds of L4 were contaminants in L3 seed lots. To simulate different contamination levels, 0, 1, 2, 5 and 10 seeds of the foreign genotype were mixed with the inbred line and then DNA was extracted from each treatment. Successive DNA samples dilutions of 0.01; 0.013; 0.02; 0.04; 0.1; 0.2; 1; 2; 5; 10 and 100% were also realized with to simulate low contamination levels. For both analysis microsatellites amplifications were performed with the primers BNLG125 for L1+L2 and BNLG240 for L3+L4. The results showed that the microsatellite technique is efficient to determine the varietal purity of inbred maize used in this research. The sensitive technique is able to detect a 0.01% DNA contaminant level. Standardization and intensity were better when a polyacrylamide matrix was used. The presence of foreign DNA in the contaminated lots was efficiently detected with the microsatellite technique, indicating the usefulness of this procedure to detect the presence of foreign seeds within maize inbred lots.