Efektywność wykorzystania kolumn chromatograficznych typu „Poroshell” w badaniach białek gliadynowych metodą RP-HPLC

Abstract

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconej fazie (RP-HPLC) jest efektywną metodą analizy polimorficznych białek roślin uprawnych, w tym również białek zapasowych zbóż. Możliwość jej powszechnego wykorzystania w hodowli roślin ogranicza jednak znaczny koszt aparatury, wyposażenia i odczynników. W ostatnich latach opracowano nowy rodzaj kolumn chromatograficznych o złożach C18 osadzonych na powierzchniowo porowatej krzemionce (tzw. Fused-Core technology). Główną zaletą tych kolumn jest wysoki wzrost zdolności rozdzielczej (zwiększenie ilości tzw. półek teoretycznych), co daje możliwość znacznego skrócenia czasu, a tym samym obniżenia kosztów analizy. Celem badań było oszacowanie dokładności i efektywności rozdziału polimorficznych białek gliadynowych metodą RP-HPLC przy użyciu kolumn typu Fused-Core w porównaniu do kolumn C18 o klasycznych parametrach ziaren krzemionki. Materiał roślinny stanowiły linie mieszańcowe pszenicy ozimej różniące się pod względem alleli kontrolujących syntezę gliadyn. Analizowano pary blisko spokrewnionych linii mieszańcowych, z których jedna zawierała null allel natomiast druga stanowiła genotyp kontrolny. Porównywano także rozdziały mieszańców z ich komponentami rodzicielskimi. Punktem odniesienia dla oceny obrazów chromatograficznych kolumny typu Fused-Core — 300SB-C18 Poroshell były rozdziały uzyskane na tradycyjnej kolumnie SB300 Zorbax C18. Wyniki badań potwierdziły, iż analiza chromatograficzna gliadyn na kolumnie Poroshell jest metodą szybką i ekonomiczną. Wysokiej jakości obrazy rozdzielonych białek uzyskiwano już w czasie 8 minut. Jednakże krótki czas rozdziału obniżył ich rozdzielczość, jedną z najważniejszych zalet chromatografii RP-HPLC. Wyniki badań sugerują, iż kolumny typu Fused-Core mogą być przede wszystkim efektywnym narzędziem selekcji masowej natomiast tradycyjne kolumny, pozwalające identyfikować subtelne szczegóły obrazu chromato¬graficznego, mogą okazać się bardziej przydatne w badaniach genetycznych np. w analizie rozszczepienia genów kontrolujących syntezę białek prolaminowych.