Electron 3D Crystallography/3D ED/MicroED

Abstract

The scattering powers of electron and X-ray differ by 4-5 orders of magnitude. Thanks to this property, the electron beam yields high-resolution diffraction spots from undersized crystals of various samples, which are hard to grow to a suitable size for X-ray diffraction even with a high-intensity synchrotron radiation beam. Thus, the technique known as electron 3D crystallography/3D ED/MicroED is recognized as being important especially in synthetic chemistry, material sciences and related areas, while single particle analysis can be used for larger-sized proteins. Here I review this technology including our recent developments and results. 1．はじめに クライオ電子顕微鏡（EM）の単粒子解析が爆発的に 普及したことで， 「クライオ EM」というワードは単粒子 解析と同義と捉えられることが多い．一方，クライオ EM の専用機を含めほとんどの透過型電子顕微鏡装置は回 折モードや視野が逃げずに傾斜できるユーセントリック 試料ステージを備え，トモグラフィーや回折パターンの 測定にも利用できる汎用性をもつ．本稿の主題である電 子線三次元結晶構造解析 /3D ED/ マイクロ ED と呼ばれ る測定も，大きな改造をせずに始められる．ただし，画 像フレームを高速で読み出せるカメラは必要である．標 準的な手順では，高分子の単結晶から X 線回折を測定 するのと同様，微小な結晶を回転させながらその回折パ ターンを記録する．解析は X 線結晶構造解析で開発され てきたソフトウェアを大きな変更なく使える．一方，測 定・ 解析精度の向上や電子線と機器に特有な問題の解 決のためには，未開拓の領域は大きいと考えている．筆 者は 2015 年に顕微鏡学会誌， 1） 2017 年には本誌に解説 2） を，その他にもいくつかの短い和文の記事を上梓してき たが，当時はこの技術はあまり注目を集めていなかった． 現在，実用的な手法に発展しつつあり，広範に及ぶ研究 分野からの期待が非常に大きいことを実感している．そ こで，改めて，以前触れていないことを中心に最新の知 見に基づきまとめたい． 2．背景 凍結した試料を電子顕微鏡でそのまま観察するクラ イオ EM 法は，技術革新を経て大きく発展した．タンパ ク質分子の実像を画像解析する単粒子解析では，試料 を結晶化することなく，また，生理的イオン環境下やい ろいろな溶液条件で，高い空間分解能で構造を明らかに できる．一方，氷中で像の解像が難しい分子量 6 ～ 8 万 未満のタンパク質や複雑な有機化合物の構造解析には， 試料の結晶化が必要であることに変わりはない．ところ が，結晶作製は難しいことが多く，微小な結晶やごく薄 い結晶しか得られないこともよく経験される．強力な放 射光を用いても X 線回折の測定には小さすぎて使用でき ないこのような結晶からでも，電子回折 （ED） では高分 解能まで回折点が得られることも多い．これは，X 線に 比べ 4 ～ 5 桁も強い電子線の試料との相互作用のおかげ である． 3） 大きな散乱能は，軽元素で構成されるタンパク 質であってもある程度の大きさがあれば，一分子（しか も数十～数百 nm の厚みの氷に包埋されている）でも解 像できることに繋がっている． 逆に，試料の厚さは問題になる．特に，試料を傾斜さ せることが必要なトモグラフィーや結晶構造解析では 深刻である．60 ° まで傾けると電子線の透過パスは 2 倍 に増えてしまう．氷包埋されたタンパク質結晶や厚い試 料では，ステージを高傾斜に傾けた際，検出器まで届く 電子線の量が極端に減り，回折点の品質は下がる．目視