Aislamiento, purificación y fusión de protoplastos de babaco (V. heilbornii) y jigacho (V. stipulata)

Abstract

En una primera fase se estandarizó protocolos de desinfección, inducción a callos friables y hojas in vitro de babaco y jigacho, material vegetal necesario para el aislamiento, purificación y fusión de protoplastos. En la fase de aislamiento se valoró la acción de tres soluciones enzimáticas que contenían celulasa Onozuka R-10 (1,5 2,25 y 3% p/v), macerozima R-10 (1,5 2,25 y 3% p/v) y pectoliasa Y-23 (0,2 0,3 y 0,4% p/v) sobre callos y hojas de las dos especies; dando los mejores resultados en número de protoplastos y tiempo de digestión el coctel que llevó las concentraciones 3% celulasa-macerozima y 0,4% pectoliasa, incubadas a 26-28oC por un período de 33 horaspara hoja y 7 horas para callo. Los protoplastos aislados fueron exitosamente purificados usando la técnica de Jadán (2000) que consistió en la aplicación de tres tipos de purificación (filtración, centrifugación directa y diferencia de gradientes en dos fases), en esta etapa se usó el medio BH3 además de sacarosa y manitol como estandarizadores osmóticos. Los protoplastos purificados de callo de babaco y hoja de jigacho fueron fusionados utilizando una solución de PEG (polietilenglicol) como agente fusionante y la solución para estabilizar la membrana de los protoplastos obtenidos, el medio BH3 fue usado posteriormente para realizar una serie de lavados con el fin de eliminar los restos de PEG, finalmente luego de culminado el proceso de fusión se observó células fusionadas de las dos especies. El siguiente paso seráestandarizar un protocolo para la regeneración de plantas a partir de fusionantes.