Photostimulation of Genetically Engineered Neurons Expressing Channelrhodopsin-2, a Light-Gated Cation Channel

Abstract

1. はじめに ニューロンの刺激には高 K + 溶液灌流法，金属電極 を用いた電気刺激法，パッチ電極を用いた単一ニュー ロンの電気刺激法，ケージド化合物を用いた光刺激法 などが用いられている．ニューロンの機能解析が蛍光 イメージング技術により非侵襲的に高い空間解像度・ 時間解像度で可能になっている現在，ニューロンの刺 激においても，ある特定の種類のニューロンだけと か，1 個のニューロンだけとか，1 個のニューロンの ある一部分だけを特異的に，効率よく，容易に，そし て侵襲性の少ない方法で刺激できる方法が求められて いる．この要求に対して，従来の方法では実現が困難 か，実現できても高い技術力や高価な機器が要求さ れ，容易に実現できないのが現状である． この問題に対して， 「光」と「遺伝子工学技術」を 用いて，ニューロンを刺激する新たな技術の開発が 試みられてきた 1)-6) ．たとえば，改変を加えた Shaker 型カリウムチャネルやイオンチャネル型グルタミン 酸受容体を光スイッチとしてはたらくアゾベンゼン 化合物で化学的に修飾して，チャネルの開閉を光で 調節する方法 3), 5), 6) や，ニューロンにショウジョウバ エの光受容カスケードを再構築して，ニューロンに 光受容能を賦与する方法 1) などが知られている．こ れらの方法でニューロンの活動を光でコントロール することは可能だが，そのためには改変したイオン チャネルや受容体を発現させた後に，光スイッチ分 子で化学的に修飾する必要性や，複数のタンパク質 を異所的に安定して細胞内に発現させる必要性など の困難さがあった．in vivo への応用を考慮した場合， これらの処置を施すのは困難である．また，刺激と ニューロンの発火の同期性という点でも，発火のタ イミングを厳密にコントロールできるものは少な かった． 2. チャネルロドプシンの発見 近年，単細胞緑藻類の一種 Chlamydomonas reinhardtii の眼点に分布しているロドプシンファミリータンパク 質が同定され，その機能が明らかにされた 7), 8) ．この タンパク質は可視光に応答してイオンを透過させて膜 電位を制御する光受容チャネルで，この分子単独で膜 電位を変化させている特徴がある．クラミドモナスに おいては 2 種類の光受容チャネル・チャネルロドプシ ン (ChR) 1 と 2 が知られている．ChR1 をアフリカツ メガエル卵母細胞に発現させると，光に応答して H + を透過させる性質をもっている 7) ．一方，ChR2 は H + のほかに Na + ，K + ，Ca 2+ などの陽イオン透過性をもち， HEK293 や BHK といった培養哺乳類細胞に発現させ ると，400-500 nm の青色光に応答した脱分極が引き 起こされることが報告されていた 8) ．筆者らは単一の 分子の中に光感受性とイオンチャネルの機能を合わせ もった ChR2 に着目して，ニューロンの光刺激への応 用を試みた． 3. チャネルロドプシン 2 の光電流特性 ChR2 は全長 737 アミノ酸残基からなるチャネルオ プシン 2 (chop2) と発色団に all-trans レチナールをも つ 複 合 タ ン パ ク 質（ChR2 = chop2 + retinal） で あ り，