High‐throughput assays for detection of the F1534C mutation in the voltage‐gated sodium channel gene in permethrin‐resistant Aedes aegypti and the distribution of this mutation throughout Thailand

Abstract

Objectives To develop rapid monitoring tools to detect the F1534C permethrin‐resistance mutation in domain IIIS6 of the Aedes aegypti voltage‐gated sodium channel gene and determine the frequency and distribution of this mutation in Thailand. Methods A TaqMan SNP genotyping and an allele specific PCR (AS‐PCR) assay were developed and validated by comparison with DNA sequencing of homozygous susceptible and homozygous resistant laboratory strains, their reciprocal‐cross progenies, and field‐caught mosquitoes. To determine the resistance phenotype of wild‐caught A. aegypti , mosquitoes were exposed to 0.75% permethrin paper. The AS‐PCR assay was used to screen 619 individuals from 20 localities throughout Thailand. Results Overall, both assays gave results consistent with DNA sequencing for laboratory strains of known genotype and for wild‐caught A. aegypti . The only slight discrepancy was for the AS‐PCR method, which overestimated the mutant allele frequency by 1.8% in wild‐caught samples. AS‐PCR assays of permethrin‐exposed samples show that the mutant C1534 allele is very closely associated with the resistant phenotype. However, 19 permethrin‐resistant individuals were homozygous for the wild‐type F1534 allele. DNA sequencing revealed all these individuals were homozygous for two other mutations in domain II, V1016G and S989P, which are known to confer resistance ( Srisawat et al. 2010 ). The F1534C mutation is widespread in Thailand with mutant allele frequencies varying among populations from 0.20 to 1.00. Conclusions These assays can be used for the rapid detection of the F1534C resistance mutation in A. aegypti populations. The F1534C, and other, mutations underlie an extremely high prevalence of pyrethroid resistance in Thailand. Objectifs: Développer des outils de surveillance rapide pour détecter la mutation de résistance au perméthrine F1534C dans le domaine IIIS6 du gène du canal sodium voltage dépendant d’ Aedes aegypti et déterminer la fréquence et la distribution de cette mutation en Thaïlande. Méthodes: Un génotypage des SNP par TaqMan et une PCR allèle spécifique (AS‐PCR) ont été développés et validés par comparaison avec le séquençage de l’ADN de souches de laboratoire homozygotes sensibles et homozygotes résistants, de leurs descendances réciproquement croisées et de moustiques capturés sur le terrain. Pour déterminer le phénotype de résistance de moustiques Ae. aegypti sauvages capturés, ceux‐ci ont été exposés à du papier à 0,75% de perméthrine. Le test AS‐PCR a été utilisé pour analyser 619 individus provenant de 20 localités à travers la Thaïlande. Résultats: En tout, les deux tests ont donné des résultats cohérents avec le séquençage de l’ADN pour les souches de laboratoire de génotype connu et pour les souches d’ Ae. aegypti sauvages capturées. La seule divergence mineure a été pour la méthode AS‐PCR, qui surestimaient la fréquence d’allèles mutants à 1,8% chez les échantillons capturés dans la nature. Le test AS‐PCR des échantillons exposés au perméthrine montre que l’allèle mutant C1534 est très étroitement associé au phénotype résistant. Cependant, 19 individus résistant au perméthrine étaient homozygotes pour l’allèle de type sauvage F1534. Le séquençage de l’ADN a révélé que tous ces individus étaient homozygotes pour deux autres mutations dans le domaine II, V1016G, connues pour conférer la résistance et la mutation S989P non rapportée précédemment. La mutation F1534C est très répandue en Thaïlande avec une fréquence des allèles mutants variant de 0,20 à 1,00 selon les populations. Conclusions: Ces tests peuvent être utilisés pour la détection rapide de la mutation de résistance F1534C dans les populations d’ Ae. aegypti . La mutation F1534C et d’autres sont à la base d’une prévalence extrêmement élevée de la résistance aux pyréthroïdes en Thaïlande. Objetivos: Desarrollar herramientas de monitorización rápidas para detectar la mutación F1534C de resistencia a permetrina en el dominio IIIS6 del gen del canal de sodio voltaje‐dependiente de Aedes aegypti, y determinar la frecuencia y la distribución de esta mutación en Tailandia. Métodos: Se desarrollaron ensayos de genotipaje TaqMan SNP y una PCR Alelo‐Específica (AS‐PCR) y se validaron mediante comparación con la secuenciación del ADN de cepas de laboratorio homocigotos susceptibles y homocigotos resistentes, sus progenies recíprocamente cruzadas, y mosquitos capturados en el campo. Para determinar el fenotipo resistente de los Ae. Aegypti capturados en el campo, se expusieron los mosquitos a papel con permetrina 0.75%. La AS‐PCR se utilizó para testear 619 individuos de 20 localidades alrededor de Tailandia. Resultados: En general, ambos ensayos dieron resultados consistentes con la secuenciación del ADN para las cepas de laboratorio de genotipo conocido y para los Ae. aegypti capturados en el campo. La única discrepancia leve era con el método AS‐PCR, el cual sobreestimaba la frecuencia del alelo mutante en 1.8% en muestras recogidas en el campo. Los ensayos AS‐PCR de muestras expuestas a la permetrina muestran que el mutante del alelo C1534 está asociado estrechamente con el fenotipo resistente. Sin embargo, 19 individuos permetrina‐resistentes eran homocigotos para el alelo F1534 salvaje. La secuenciación del ADN reveló que todos estos individuos eran homocigotos para otras dos mutaciones en el dominio II, V1016G, reconocido por conferir resistencia, y el previamente no reportado S989P. La mutación F1534C está muy extendida en Tailandia, con las frecuencias alélicas mutantes variando entre la población de 0.20‐1.00. Conclusiones: Estos ensayos pueden utilizarse para la detección rápida de la mutación de resistencia F1534C en la población de Ae. aegypti . La F1534C, y otras mutaciones subyacen la prevalencia extremadamente alta de resistencia a piretroides en Tailandia.