Entwicklung einer DNA‐Polymerase für die direkte m 6 A‐Sequenzierung

Abstract

Methoden zur Analyse von RNA‐Modifikationen sind essenziell für das Forschungsfeld der Epitranskriptomik. N 6 ‐Methyladenosin (m 6 A) ist die häufigste Modifikation in der mRNA von Säugetieren und erfüllt Funktionen in der Regulation der Genexpression. Techniken zur Detektion dieser Modifikation basieren derzeit auf der Anreicherung von m 6 A‐haltigen RNA‐Fragmenten durch Antikörper. Dieser m 6 A‐spezifische Schritt vor der Sequenzierung ist nötig, da die Information über die Modifikation während der reversen Transkription (RT) gelöscht wird. Um die Nachteile einer solchen indirekten Detektion zu überwinden, haben wir uns zum Ziel gesetzt, neue DNA‐Polymerasen zu entwickeln, die eine direkte m 6 A‐Sequenzierung ermöglichen. Zu diesem Zweck wurde ein Verfahren etabliert, das die Identifizierung von RT‐aktiven KlenTaq‐DNA‐Polymerase‐Varianten mit einer erhöhten Fehleinbaurate gegenüber m 6 A ermöglicht. So konnten m 6 A‐haltige Stellen direkt aus RNA‐Sequenzierungsdaten identifiziert werden.