Comparación de métodos para la recuperación de ADN a partir de geles de agarosa

Abstract

Se ensayaron cuatro métodos para la recuperación de ADN separado por electro-foresis en gel de agarosa. Se usaron diferentes cantidades y tamaños de ADN. Se discuten las condiciones especiales, los cuidados de cada método y la recuperación según el tamaño y las cantidades iniciales utilizadas. La frecuente necesidad de recuperar y purifi-car fragmentos de ADN separados sobre geles de agarosa y poliacrilamida ha llevado al desa-rrollo de gran variedad de métodos (1-9). Tenien-do en cuenta que ninguno ha mostrado ser ple-namente satisfactorio, se han realizado modifi-caciones a cada uno de ellos con el fin de hacerlos más eficientes. Uno de los métodos utilizados es la electrofo-resis y recuperación sobre un papel de DEAE-ce lulosa. Es una técnica simple que se puede aplicar a varias muestras simultáneamente. El ADN obtenido es de alta pureza. El método fue inicialmente desarrollado por Girvitz quien utilizó membranas de diálisis (1). Posteriormente es modificado introduciéndose las membranas de DEAE-celulosa que tienen la ventaja de no libe-rar fibras, presenta una matriz de mayor densi-dad y estár cargadas positivamente por la intro-ducción de grupos amino (2, 3). El método se basa en la unión del ADN a las membranas por interacciones electrostáticas, entre las cargas positivas en la membrana y las cargas negativas del ADN. La elución del ADN se hace con un buffer de alta fuerza iónica. La electroelución (EE) fue usada por primera vez por McDonell en 1977 (4). El método consiste en cortar el fragmento de gel que contiene el ADN que se quiere purificar, introducirlo en una bolsa de diálisis con un buffer, someter la bolsa a un campo eléctrico para sacar el ADN de la agarosa, purificarlo mediante extracciones orgánicas y concentrarlo por precipitación etanólica Otro procedimiento es hacer electroforesis empleando agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) y cortar el fragmento de gel que contiene el ADN que sedesea purificar, fundirlo y, median-te extracciones orgánicas, retirar la agarosa. El ADN queda en la fase acuosa (9). La utilización de matriz de sílica fue descrita por Vogelstein en 1979 (7). Se basa en la unión del ADN de cadena sencilla y doble a la matriz a través de interacciones polares débiles. La elución del ADN se hace con un solvente polar (H,O). Se probaron los cuatro métodos menciona-dos. Se separaron fragmentos de ADN de tres tamaños y de cada uno tres cantidades diferen-tes (tabla 1). n s t t u t